Author: Silvia Moreno
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Company: Universidad de Buenos Aires

Instructivo para la interpretación y procesamiento de los datos de espectrometría de masa con el equipo MALDI TOF TOF Ultraflex II de Bruker Daltonics.

En el presente informe se adjunta:

A) Archivo de Excel con la lista de muestras conteniendo links a las búsquedas realizadas en MASCOT. Se realiza por muestra una búsqueda con la lista de picos trípticos de la muestra o fingerprinting (MS). También se realizan búsquedas independientes ingresando la/s lista/s de picos resultado de la fragmentación (MS/MS) de alguno/s de los picos más intensos del MS. Finalmente, cada vez que sea posible realizamos búsquedas donde combinamos la información de MS, con el MS/MS de uno o más peptidos. De esta forma se mejoran los scores . Sin embargo, el score obtenido, puede depender de las variables que uno ingresa al MASCOT junto con la lista de picos. Se informan sólo las búsquedas consideradas positivas o de resultado dudoso, en algunos casos, se informa en rojo resultados con score bajo, no significativo, que puedan parecer relevantes. Las variables utilizadas para las búsquedas con MASCOT son:
•	error (ppm): de 20 a 250.
•	missed cleavages: 0 a 2
•	taxonomía: según convenga, a veces se puede hacer contra all entries, contra algún grupo en particular (i.e., archaea, mammalia,...) o especie en particular. O contra bases EST en caso de que la muestra a genomas no conocidos
•	error (Da, en caso del MS/MS): 0.1 a 2.5Da.

Cliqueando en cada uno de los links se puede:
•	realizar una nueva búsqueda con el mismo set de datos, cambiando variables.
•	imprimir la hoja-informe de MASCOT y su gráfico de barras, así como también analizar las otras soluciones posibles de menor score (es común encontrar, sobre todo en geles monodimensionales, más de una proteína por banda)
•	Hacer search unmatched, es decir, una nueva búsqueda utilizando los picos restantes que no pertenecen a la solución principal.

Estos links son permanentes en la red. De ahi se pueden ubicar los resultados de la búsqueda (una figura donde se muestra la significancia del score); haciendo click en el hit se abre otra ventana con los péptidos indentificados para esa proteína, las secuencias, los errores, etc.

B) Lista de picos en Excel del MS y, en caso de haberse realizado exitosamente, el/los MS/MS. En una muestra con mucha cantidad de proteína (en general, de gel monodimensional y tinción con Coomassie) se pueden realizar potencialmente hasta 5-10 secuenciaciones (MS/MS). Estas listas de picos pueden ser reingresadas en MASCOT (http://www.matrixscience.com/) para hacer nuevamente la búsqueda (hay algunos resultados negativos que pueden ser revertidos modificando las variables enumeradas en A) o en otros buscadores.
La lista de iones derivados de la fragmentacion MS/MS se entrega en formato mgf que es el que acepta MASCOT, en un unico archivo por muestra. Ese archivo se puede leer como un archivo de texto y observar que puede contener informacion de fragmentacion de más de un pico de esa muestra. Si interesa se puede subdividir en tantos archivos como picos fragmentados; siempre respetando el formato mgf y salvando el archivo como texto, con la extension mgf.

Por ejemplo:

Se puede ingresar la lista de picos en:
http://prospector.ucsf.edu/mshome.htm
y realizar una búsqueda independiente de MASCOT.

Para organismos con genomas no totalmente secuenciados, la lista de picos de MS/MS puede ser ingresada en:
http://www.bioinfor.com:8080/peaksonline/
o en 
http://www.bioinformaticssolutions.com/products/peaks/proteinID.php
para secuenciación de novo. Probar siempre con controles positivos (fragmentaciones de péptidos conocidos) ya que estos y otros programas se encuentran aún en etapa de desarrollo.

En caso de tener una secuencia hipotética para un determinado pico, la fragmentación teórica de ese pico puede realizarse ingresando la secuencia en
http://prospector.ucsf.edu/cgi-bin/msform.cgi?form=msproduct
y comparándola pico a pico con el MS/MS experimental.

C) Gráficos del MS y MS/MS en formato *.emf. que pueden ser leídos con cualquier programa para visualización de imágenes. Los picos no etiquetados corresponden a péptidos pertencientes a queratinas y a autoclivaje de la tripsina, y fueron utilizados como estandares internos, y luego removidos de la lista de picos. Los picos que aparecen con mayor intensidad, son susceptibles de ser fragmentados y secuenciados, ya sea trabajando sobre la muestra ya procesada y colocada en el target o reprocesando algun posible sobrante o duplicado enviado por el usuario.

D) (opcional, a pedido) En caso de tener el usuario acceso al programa de BRUKER-DALTONICS, FlexAnalysis, podemos enviar comprimidos (formato *.zip) los archivos originales, calibrados y procesados, que permiten al usuario un análisis más profundo y una manipulación más fácil de sus espectros. La calibración de los espectros es realizada con estándares externos provistos por el servicio y luego una calibración fina con estándares internos, aprovechando keratinas que en mayor o menor medida aparecen en la muestra. Luego los picos de keratina son borrados automáticamente del espectro, razón por la cual es común encontrar picos de buena resolución no asignados.

De todas maneras, recomendamos en caso de resultados negativos el reenvío de la muestra, chequeando previamente si:
•	La cantidad no era demasiado exigua y si se puede preparar más cantidad sumando varios geles.
•	El método de tinción (sobre todo en métodos de tinción con plata) era compatible con MS.
•	La cantidad de contaminantes trípticos y queratinicos no fue excesiva.

En caso de resultados positivos se pueden re-chequear secuenciando más peptidos, reprocesando excesos de muestra no procesados y guardados por el servicio, o idealmente reprocesando una muestra obtenida independientemente pero en las mismas condiciones.

Su consulta no molesta. No dude en escribirnos.

Dra Silvia Moreno                                                Dra. Pía Valacco (bióloga).
Directora CEQUIBIEM                                              Técnico CEQUIBIEM.

                                    cequibiem-servicios@qb.fcen.uba.ar